Lidokaina w raku piersi HER2+: nowy mechanizm molekularny OGT-CCNL1

Czy lidokaina może hamować proliferację komórek raka piersi HER2-positive?

Rak piersi HER2-positive stanowi około 15–20% wszystkich nowotworów piersi i charakteryzuje się agresywnym przebiegiem klinicznym oraz z natury złym rokowaniem bez terapii celowanej. Mimo że trastuzumab, pertuzumab i koniugaty przeciwciało-lek znacząco poprawiły przeżywalność, oporność wrodzona lub nabyta pozostaje częstym problemem. Dodatkowo leki skierowane przeciwko HER2 wiążą się z kardiotoksycznością i powikłaniami zakrzepowo-zatorowymi, a nowotwory pozbawione ekspresji ER/PR nie mogą skorzystać z kombinacji endokrynnych.

Lidokaina – powszechnie stosowany środek znieczulający miejscowo i antyarytmiczny – w ostatnich latach przyciąga uwagę jako potencjalny agent przeciwnowotorowy. Rosnąca liczba dowodów wskazuje, że lidokaina hamuje proliferację komórek nowotworowych i promuje apoptozę w modelach in vitro różnych nowotworów, w tym raka krtani, żołądka, jelita grubego, płuc, wątrobowokomórkowego i czerniaka. Najnowsze dane sugerują, że okołooperacyjna infuzja lidokainy u pacjentek po operacji raka piersi przejściowo zmniejsza pooperacyjny ból i zużycie morfiny, jednocześnie hamując przerzuty i nawroty poprzez blokowanie sygnalizacji TGF-β/Smad oraz reprogramowanie makrofagów związanych z nowotworem.

Jednak rola lidokainy w raku piersi HER2-positive pozostaje niejasna. Badania przedkliniczne sugerują, że lidokaina może zwiększać wrażliwość komórek nowotworowych na chemioterapeutyki poprzez różnorodne mechanizmy, z których regulacja epigenetyczna jawi się jako kluczowy szlak. O-GlcNAcylacja – dynamiczna i odwracalna modyfikacja potranslacyjna – odgrywa istotną rolę w metabolicznym reprogramowaniu raka piersi HER2-positive. Jej poziom koreluje pozytywnie z ekspresją PKM2 i wspólnie przewiduje gorsze przeżycie w raku luminalnym HR+/HER2-, wskazując na potencjał jako biomarkera metabolicznego ryzyka nawrotu.

Jak przeprowadzono badanie molekularne lidokainy?

Badanie wykonano na ludzkich liniach komórkowych raka piersi HER2-positive (AU565, BT474) oraz nietransformowanej linii nabłonkowej MCF-10A jako kontroli. Komórki hodowano w odpowiednich podłożach (RPMI-1640 dla AU565, DMEM dla BT474, DMEM/F12 dla MCF-10A) z dodatkiem surowicy płodowej bydlęcej i antybiotyków w standardowych warunkach (37°C, 5% CO₂).

Lidokainę (Sigma-Aldrich) rozpuszczono w sterylnym PBS do stężenia 100 mM. Komórki wysiano do płytek 6-dołkowych w gęstości 5×10⁵ komórek/dołek i po 24 godzinach traktowano lidokainą w końcowych stężeniach 0 (kontrola), 0,5, 1 i 2 mM przez kolejne 24 godziny.

Ocena żywotności i proliferacji: Test CCK-8 (Dojindo) przeprowadzono na komórkach wysianych w płytkach 96-dołkowych (5×10³/dołek). Po dodaniu 10 µL odczynnika CCK-8 i 2-godzinnej inkubacji mierzono absorbancję przy 450 nm. Test EdU (Thermo Fisher Scientific) z inkubacją 10 µM EdU przez 2 godziny pozwolił na wizualizację nowo syntetyzowanego DNA. Jądra barwiono Hoechst 33342, obrazy rejestrowano mikroskopem fluorescencyjnym Nikon Eclipse Ts2R i analizowano w ImageJ.

Analiza cyklu komórkowego: Komórki po traktowaniu lidokainą utrwalono w 70% etanolu na noc w 4°C, trawiono RNazą A i barwiono jodkiem propidyny (50 µg/mL). Dane zbierano na cytometrze przepływowym BD FACSCanto II (minimum 10 000 zdarzeń/próbka) i analizowano w FlowJo (wersja 10.8.1).

Western blot i immunoprecypitacja: Białka ekstrahowano buforem RIPA z inhibitorami proteaz i PMSF, rozdzielano na żelach SDS-PAGE 10% i przenoszono na membrany PVDF. Inkubowano z przeciwciałami: anty-O-GlcNAc (CTD110.6, 1:1000), anty-OGT (1:500), anty-OGA (1:1000), anty-CCNL1 (1:600), anty-β-aktyna (1:5000). Sygnał detekcji chemiluminescencji rejestrowano systemem Azure Biosystems C600, a intensywność prążków kwantyfikowano w Image Lab 6.0. Do immunoprecypitacji wykorzystano Protein A/G Magnetic Beads (Thermo Fisher) z przeciwciałami anty-CCNL1 lub anty-OGT, po czym analizowano Western blotem.

RT-qPCR: RNA ekstrahowano TRIzolem (Invitrogen), cDNA syntetyzowano zestawem PrimeScript RT Master Mix (Takara), a qPCR wykonywano z TB Green Premix Ex Taq II na systemie Bio-Rad CFX96. Startery: OGT, CCNL1, GAPDH (kontrola).

Dokowanie molekularne: Strukturę 3D lidokainy pobrano z PubChem, zminimalizowano energetycznie w Chem3D i zaimportowano do Schrödingera. Strukturę krystaliczną OGT (PDB: 5NPS) przygotowano w Maestro 11.9 (usunięcie wody krystalicznej, dodanie wodorów, minimalizacja). Dokowanie przeprowadzono modułem Glide.

Mutageneza miejscowa CCNL1: Mutacje seryna→alanina (S65A, S69A, S166A, S422A) wprowadzono zestawem Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit (New England Biolabs). Konstrukty zweryfikowano sekwencjonowaniem Sangera, transfekowano do komórek i selekcjonowano puromycyną (1 µg/mL) przez 10 dni. Ekspresję potwierdzono Western blotem.

Analiza stabilności białka CCNL1: Test chase z cykloheksymidem (CHX, 100 µg/mL) – komórki zbierano w punktach czasowych 0, 2, 4, 8 godzin i analizowano poziom CCNL1 Western blotem.

Jak lidokaina wpływa na proliferację komórek HER2-positive?

Test CCK-8 wykazał znaczącą, zależną od stężenia redukcję żywotności komórek raka piersi HER2-positive po ekspozycji na lidokainę. W porównaniu do grupy kontrolnej nieleczonej, lidokaina w stężeniu 2 mM zmniejszyła żywotność komórek o ponad 50% (p<0,001). Co istotne, lidokaina nie wpłynęła istotnie na żywotność komórek MCF-10A w zakresie do 2 mM (p>0,05), co sugeruje selektywność wobec komórek nowotworowych.

Testy inkorporacji EdU potwierdziły wyraźne zahamowanie syntezy DNA. W komórkach nieleczonych odsetek EdU-pozytywnych przekraczał 50%, co wskazuje na aktywną proliferację. Jednak leczenie lidokainą skutkowało zależnym od stężenia spadkiem odsetka komórek EdU-pozytywnych, przy czym najwyższe stężenie (2 mM) redukowało ten wskaźnik do około 20% (p<0,001).

Analiza cyklu komórkowego metodą cytometrii przepływowej ujawniła, że lidokaina indukuje znaczącą akumulację komórek w fazie G0/G1, z jednoczesnym spadkiem w fazach S i G2/M. W komórkach AU565 odsetek komórek w G0/G1 wzrastał od wartości wyjściowej przy 0,5 mM (p<0,01) i osiągał szczyt przy 2 mM (p<0,001), podczas gdy populacja fazy S była znacząco zmniejszona (p<0,01 przy 2 mM). Podobne trendy zatrzymania w G0/G1 zaobserwowano w komórkach BT474.

“Nasze wyniki wskazują, że lidokaina wywiera zależny od stężenia efekt hamujący na żywotność i proliferację komórek poprzez indukcję zatrzymania cyklu komórkowego w raku piersi HER2-positive” – konkludują autorzy badania.

Czy lidokaina moduluje O-GlcNAcylację w komórkach raka piersi?

Aby zbadać mechanizm molekularny, autorzy przeanalizowali wpływ lidokainy na O-GlcNAcylację i jej enzymy regulatorowe. Analiza Western blot wykazała, że leczenie lidokainą znacząco zmniejszyło globalne poziomy O-GlcNAcylacji białek zarówno w komórkach AU565, jak i BT474. Dodatkowo ekspresja OGT – enzymu odpowiedzialnego za dodawanie modyfikacji O-GlcNAc – była wyraźnie obniżona po leczeniu lidokainą, podczas gdy ekspresja OGA (enzymu usuwającego modyfikacje O-GlcNAc) pozostawała względnie niezmieniona.

Te odkrycia sugerują, że lidokaina hamuje O-GlcNAcylację przynajmniej częściowo poprzez redukcję ekspresji OGT. Aby zbadać, czy lidokaina może bezpośrednio oddziaływać z OGT, przeprowadzono analizę dokowania molekularnego. Wyniki wskazały, że lidokaina może wiązać się z OGT z powinowactwem wiązania wynoszącym -6,382 kcal/mol. Przewidywana poza wiązania pokazała lidokainę zajmującą kieszeń w obrębie centrum aktywnego OGT, gdzie tworzy wiązania wodorowe i interakcje hydrofobowe z kluczowymi resztami aminokwasowymi.

Te wyniki in silico sugerują, że lidokaina może bezpośrednio hamować aktywność katalityczną OGT, przyczyniając się w ten sposób do redukcji poziomów O-GlcNAcylacji w komórkach raka piersi. Jednak autorzy podkreślają, że precyzyjny mechanizm obniżenia poziomu OGT – czy poprzez represję transkrypcyjną, zwiększony obrót mRNA, czy bezpośrednie interakcje lek-białko – wymaga dalszych badań.

Jaka jest rola osi OGT-CCNL1 w proliferacji komórek raka piersi?

Aby zidentyfikować efektory podrzędne OGT, które pośredniczą w jego roli proproliferacyjnej, autorzy przeanalizowali bazę danych TCGA-BRCA w poszukiwaniu transkryptów, których obfitość pozytywnie koreluje z ekspresją OGT. Analiza korelacji Pearsona ujawniła grupę genów znacząco skorelowanych z ekspresją OGT. Wśród najważniejszych kandydatów zidentyfikowano CCNL1 jako gen, którego ekspresja była pozytywnie skorelowana z ekspresją OGT.

Aby zbadać tę zależność, wyciszono OGT za pomocą shRNA (shOGT) i potwierdzono znaczącą redukcję poziomu mRNA OGT zarówno w komórkach AU565, jak i BT474 (p<0,001). Co istotne, wyciszenie OGT prowadziło również do wyraźnego spadku ekspresji mRNA CCNL1 (p<0,001). Na poziomie białkowym analiza Western blot potwierdziła, że wyciszenie OGT zmniejszyło zarówno poziom OGT, jak i CCNL1. Dodatkowo O-GlcNAcylacja CCNL1 była znacząco zredukowana.

Testy ko-immunoprecypitacji (Co-IP) wykazały bezpośrednią interakcję fizyczną między OGT i CCNL1 w komórkach AU565 i BT474. Następnie poszukiwano specyficznych miejsc O-GlcNAcylacji na CCNL1. Analiza in silico przewidziała kilka potencjalnych miejsc O-GlcNAcylacji, przy czym S65, S69, S166 i S422 wykazywały wysokie wyniki. Aby zwalidować te przewidywania, przeprowadzono mutagenezę miejscową. Analiza Western blot mutantów CCNL1 ujawniła, że mutacja S65A, ale nie pozostałe, wyraźnie zmniejszyła zarówno całkowity poziom białka CCNL1, jak i jego O-GlcNAcylację.

Ponadto test chase z cykloheksymidem (CHX) wykazał, że wyciszenie OGT przyspiesza degradację białka CCNL1. Łącznie te odkrycia sugerują, że OGT stabilizuje białko CCNL1 poprzez O-GlcNAcylację, głównie w pozycji reszty S65.

Czy przywrócenie ekspresji OGT lub CCNL1 ratuje efekt lidokainy?

Aby potwierdzić, że efekty antyproliferacyjne lidokainy są mediowane przez OGT, przeprowadzono eksperymenty typu rescue. Najpierw potwierdzono efektywną nadekspresję OGT w komórkach AU565 i BT474 po transdukcji lentiwirusem ekspresyjnym OGT (p<0,001). Następnie nadeksprymowano OGT w komórkach leczonych lidokainą.

Testy żywotności komórek wykazały, że nadekspresja OGT częściowo ratowała supresyjny efekt lidokainy na żywotność komórek (p<0,001). Konsekwentnie testy inkorporacji EdU pokazały, że nadekspresja OGT znacząco zwiększyła odsetek komórek EdU-pozytywnych w komórkach leczonych lidokainą (p<0,001). Ponadto analiza cyklu komórkowego ujawniła, że nadekspresja OGT częściowo łagodziła indukowane lidokainą zatrzymanie w fazie G0/G1.

W kolejnym kroku przeprowadzono eksperymenty rescue poprzez nadekspresję CCNL1 w komórkach z wyciszonym OGT. Najpierw potwierdzono efektywną nadekspresję CCNL1 zarówno w komórkach AU565, jak i BT474 (p<0,001). Jak oczekiwano, wyciszenie OGT (shOGT) znacząco zmniejszyło żywotność komórek do około 40% w AU565 i 30% w BT474, w porównaniu do grupy kontrolnej shNC (p<0,001).

Co istotne, ponowna ekspresja CCNL1 w tych komórkach z wyciszonym OGT częściowo przywróciła żywotność komórek do około 60% w AU565 i 50% w BT474 (p<0,01). Konsekwentnie testy EdU wykazały, że wyciszenie OGT zmniejszyło odsetek komórek EdU-pozytywnych do około 20% w AU565 i 15% w BT474. Natomiast nadekspresja CCNL1 w tych komórkach zwiększyła wskaźnik EdU-pozytywnych do około 40% w AU565 i 35% w BT474 (p<0,01).

Analiza cytometryczna ujawniła, że podczas gdy wyciszenie OGT indukowało zatrzymanie w fazie G0/G1, efekt ten był znacząco łagodzony przez nadekspresję CCNL1, która zmniejszała populację G0/G1 do około 50% w AU565 i 45% w BT474 (p<0,001). Łącznie te odkrycia ustanawiają CCNL1 jako krytyczny efektor podrzędny, poprzez który OGT promuje proliferację komórek raka piersi i progresję cyklu komórkowego.

Co te odkrycia oznaczają dla leczenia raka piersi HER2-positive?

Zarządzanie rakiem piersi, szczególnie HER2-positive, stanowi istotne wyzwanie terapeutyczne ze względu na heterogeniczność i oporność na leki. Obecne leczenie często napotyka ograniczenia, co skłania do poszukiwania nowych strategii terapeutycznych. W ostatnich latach ponowne wykorzystanie znanych leków (drug repurposing) wyłoniło się jako obiecująca droga w terapii nowotworów, a lidokaina – powszechnie stosowany środek znieczulający miejscowo – została zidentyfikowana jako potencjalny agent przeciwnowotorowy.

Wcześniejsze badania wykazały, że lidokaina może hamować proliferację komórek nowotworowych i indukować apoptozę w różnych nowotworach, w tym raku piersi, poprzez modulację wielu szlaków sygnałowych, takich jak szlak PI3K/AKT/mTOR i indukcję autofagii. Obecne badanie rozszerza te obserwacje, wyjaśniając, że lidokaina indukuje silne zatrzymanie cyklu komórkowego w fazie G0/G1, dostarczając w ten sposób bardziej bezpośredniej podstawy mechanistycznej dla jej efektów antyproliferacyjnych.

Zagłębiając się w mechanizmy molekularne leżące u podstaw działania lidokainy, badanie ujawniło nowe powiązanie między lidokainą a regulacją O-GlcNAcylacji. Odkryto, że lidokaina obniża ekspresję OGT, prowadząc do globalnej redukcji poziomów O-GlcNAcylacji. O-GlcNAcylacja to dynamiczna modyfikacja potranslacyjna odgrywająca kluczową rolę w progresji nowotworów poprzez regulację stabilności białek, transkrypcji genów i sygnalizacji komórkowej. To odkrycie jest szczególnie istotne, biorąc pod uwagę, że nadmierna O-GlcNAcylacja jest często obserwowana w nowotworach i wiąże się ze wzmożoną proliferacją i przeżywalnością komórek.

Centralne odkrycie tego badania to identyfikacja CCNL1 jako kluczowego substratu podrzędnego OGT w komórkach raka piersi przy użyciu bazy danych TCGA-BRCA. CCNL1 należy do superrodziny cykliny i funkcjonuje jako pozytywny regulator elongacji RNA-pol-II i progresji G1/S; jego nadekspresja jest związana z rakiem piersi. Wyniki pokazały, że OGT oddziałuje z CCNL1 i stabilizuje go poprzez O-GlcNAcylację, co dostarcza nowego mechanistycznego powiązania między wyczuwaniem substratów odżywczych a kontrolą cyklu komórkowego.

Funkcjonalne znaczenie tej osi zostało dodatkowo potwierdzone przez eksperymenty rescue. Wykazano, że przywrócenie ekspresji OGT lub CCNL1 może częściowo przeciwdziałać efektom antyproliferacyjnym lidokainy. To dostarcza przekonujących dowodów, że działanie hamujące lidokainy jest, przynajmniej częściowo, zależne od jej zdolności do zakłócania tego specyficznego szlaku. Te odkrycia sugerują, że celowanie w oś OGT-CCNL1 może być obiecującą strategią zwiększania skuteczności przeciwnowotorowej lidokainy w leczeniu raka piersi.

Jakie są ograniczenia badania i kierunki dalszych prac?

Chociaż obecna praca ustanawia oś OGT-CCNL1 jako moduł możliwy do zastosowania farmakologicznego w raku piersi HER2-positive, pozostaje ona dowodem koncepcji in vitro. Klinicznie lidokaina ma wąskie okno terapeutyczne (1,2–5,5 µg/mL), z ograniczonym marginesem między górną granicą zakresu terapeutycznego a stężeniami toksycznymi (>9 µg/mL). U pacjentów z niewydolnością serca lub chorobami wątroby zmiany farmakokinetyczne znacząco zwiększają ryzyko akumulacji leku i toksyczności przy podawaniu standardowych dawek.

Dlatego dostosowanie dawki jest konieczne, a monitorowanie stężenia leku szczególnie ważne w tych grupach wysokiego ryzyka. Dedykowane modele ortotopowe myszy HER2-positive oraz badania farmakokinetyczne powinny być zaplanowane w przyszłości, aby określić optymalną dawkę, formulację i okno leczenia przed jakąkolwiek oceną kliniczną.

Ponadto, chociaż obecne badanie wykazuje, że lidokaina obniża poziom białka OGT i osłabia proliferację komórek raka piersi HER2-positive, precyzyjny mechanizm leżący u podstaw redukcji obfitości OGT – czy poprzez represję transkrypcyjną, zwiększony obrót mRNA, czy bezpośrednie interakcje lek-białko – pozostaje do wyjaśnienia. Podobnie względny wkład zmniejszonej ekspresji OGT w porównaniu z hamowaniem jej aktywności enzymatycznej w obserwowane efekty przeciwnowotorowe nie został formalnie rozdzielony.

Chociaż dane pokazują, że mutant S65A wykazuje zmniejszoną całkowitą obfitość CCNL1 i niższe poziomy O-GlcNAcylowanego CCNL1 w porównaniu z białkiem typu dzikiego, bezpośredni dowód biochemiczny – taki jak immunoblotting RL2 lub testy glikozylacji in vitro – powinien zostać uzyskany w przyszłości, aby potwierdzić, czy CCNL1 jest rzeczywiście O-GlcNAcylowany w pozycji Ser-65.

“Przyszłe badania przedkliniczne i kliniczne są uzasadnione, aby zwalidować te odkrycia in vivo i przenieść tę strategię do praktyki klinicznej, z ostatecznym celem poprawy wyników dla pacjentek z rakiem piersi HER2-positive” – podkreślają autorzy.

Czy lidokaina może stać się nową opcją terapeutyczną w raku HER2-positive?

Badanie wyjaśnia nowy mechanizm molekularny leżący u podstaw działania przeciwnowotorowego lidokainy w raku piersi HER2-positive. Wykazano, że lidokaina hamuje proliferację i indukuje zatrzymanie cyklu komórkowego w fazie G0/G1 poprzez obniżenie poziomu OGT. To z kolei prowadzi do zmniejszonej O-GlcNAcylacji i późniejszej destabilizacji regulatora cyklu komórkowego CCNL1. Te mechanistyczne odkrycia są zgodne z obserwacjami klinicznymi pokazującymi, że lidokaina może zwiększać skuteczność środków chemioterapeutycznych i zmniejszać powikłania pooperacyjne u pacjentów z nowotworami. Praca dostarcza silnego molekularnego uzasadnienia dla klinicznego badania lidokainy jako terapii adjuwantowej, szczególnie dla pacjentek z rakiem piersi HER2-positive, które nie mają konwencjonalnych celów hormonalnych. Odkrywając oś OGT-CCNL1 jako kluczowy cel lidokainy, badanie to otwiera nowe możliwości rozwoju innowacyjnych strategii terapeutycznych przeciwko rakowi piersi HER2-positive.