Lidokaina jako wsparcie elektroporacji – nowe perspektywy w terapii

Czy lidokaina może wspierać elektroporację w terapiach medycznych?

Badanie eksperymentalne przeprowadzone przez zespół naukowców oceniło wpływ lidokainy na efekty elektroporacji w warunkach in vitro. Elektroporacja to zjawisko przejściowego zwiększenia przepuszczalności błony komórkowej pod wpływem impulsów elektrycznych, szeroko stosowane w medycynie, biotechnologii i technologii żywności. W medycynie klinicznej wykorzystuje się elektroporację w elektrochemioterapii, nieodwracalnej elektroporacji do ablacji tkanek (nowotworowych, sercowych) oraz w elektrotransferze genów.

Badanie przeprowadzono na czterech liniach komórkowych: mysich komórkach czerniaka B16-F1 (model dla guzów skórnych i przerzutów), mysich mioblastach C2C12 (model dla elektrotransferu genów), komórkach CHO-K1 (model o niskiej ekspresji endogennych kanałów jonowych) oraz komórkach NS-HEK ze stabilną ekspresją kanałów Na_V1.5. Eksperymenty wykonano w dwóch różnych roztworach elektroporacyjnych: o niskiej przewodności oraz w roztworze Tyrode’a, który naśladuje typową przewodność i skład jonowy płynów pozakomórkowych. Zastosowano 10-minutową inkubację z lidokainą w dwóch stężeniach: 10 mM (0,3%), zgodnie z wcześniejszymi badaniami in vitro, oraz 35 mM (1%), odpowiadającym standardowej dawce znieczulenia.

Procedura eksperymentalna obejmowała cztery etapy: (1) inkubację komórek w wybranym roztworze elektroporacyjnym z lidokainą lub bez niej przez 10 minut; (2) ekspozycję komórek na 8 impulsów elektrycznych o czasie trwania 100 µs, dostarczanych z częstotliwością 1 Hz; (3) ocenę przepuszczalności błony komórkowej na podstawie wnikania jodku propidyny (PI) przy użyciu cytometrii przepływowej 3 minuty po elektroporacji; oraz (4) ocenę przeżywalności komórek 24 godziny po elektroporacji poprzez barwienie martwych komórek PI i zliczanie żywych, niewybarwionych komórek za pomocą cytometrii przepływowej.

Jakie rezultaty osiągamy przy różnych stężeniach lidokainy?

Wyniki badania wykazały, że lidokaina w stężeniu 10 mM (0,3%) ma umiarkowany wpływ na przepuszczalność błony komórkowej i przeżywalność komórek. Obniżenie natężenia pola elektrycznego potrzebnego do osiągnięcia 50% przepuszczalności błony (E_mid) nie przekraczało 16%, a dla 50% przeżywalności komórek nie przekraczało 18%. Efekt był częściowo zależny od typu komórek, przy czym najwyraźniejszy wpływ zaobserwowano w komórkach czerniaka B16-F1. W przypadku tych komórek, 10 mM lidokaina zwiększyła objętość tkanki podlegającej odwracalnej elektroporacji (RE) o 22,2%, a objętość tkanki podlegającej nieodwracalnej elektroporacji (IRE) o 43,7% w uproszczonym modelu numerycznym.

Przy wyższym stężeniu lidokainy (35 mM, 1%), zaobserwowano znacznie silniejszy efekt na przeżywalność komórek B16-F1, z obniżeniem E_mid o 25-40%. Co istotne, wpływ na przeżywalność komórek był nieproporcjonalnie większy niż na przepuszczalność błony, co sugeruje, że zwiększone wchłanianie lidokainy przez elektroporowane błony nasila jej wewnętrzną cytotoksyczność, zamiast po prostu powodować nadmierne uszkodzenie błony. Przy stężeniu 35 mM lidokainy objętość tkanki podlegającej nieodwracalnej elektroporacji (IRE) wzrosła prawie dwukrotnie (99,4%) w warunkach bez korekty pH, a po korekcie pH do 7,3 wzrost ten wyniósł aż 184,9%.

Badacze zauważyli, że efekt lidokainy obserwowany w ich badaniu był mniej wyraźny niż w poprzednich badaniach in vitro, co przypisują bardziej rygorystycznym kontrolom eksperymentalnym. Zapewnili oni porównywalne pH, przewodność, osmolalność i rozcieńczenie roztworu elektroporacyjnego zarówno w grupach z lidokainą, jak i kontrolnych. Dodanie 10 mM lidokainy do roztworu o niskiej przewodności powodowało zmniejszenie pH z 7,0 do 6,6 i zwiększenie przewodności z 0,87 mS/cm do 2,41 mS/cm, podczas gdy osmolalność pozostawała praktycznie niezmieniona. Te zmiany mogły wpływać na wyniki poprzednich badań, które nie kontrolowały tych parametrów tak dokładnie.

Jakie mechanizmy stoją za działaniem lidokainy i jakie są perspektywy kliniczne?

Mechanizm działania lidokainy może obejmować modulację ładunku powierzchniowego błony komórkowej, bezpośrednie interakcje z fosfolipidami (zwiększenie płynności błony i elastyczności zginania), a także interakcje z kanałami sodowymi zależnymi od napięcia. Badania eksperymentalne na modelowych błonach lipidowych i symulacje dynamiki molekularnej wykazały, że lidokaina oddziałuje bezpośrednio z fosfolipidami, zwiększając płynność błony i elastyczność zginania, jednocześnie obniżając temperaturę przejścia fazowego lipidów. Charakter tych interakcji zależy od stanu protonowania lidokainy: forma naładowana lokalizuje się preferencyjnie w regionie grup głównych lipidów, podczas gdy forma nienaładowana może penetrować do hydrofobowego rdzenia lipidowego i przechodzić przez dwuwarstwę.

Dodatkowo, lidokaina może hamować ATPazy związane z błoną, upośledzając mechanizmy naprawy błony i przywracania wewnątrzkomórkowej homeostazy jonowej po elektroporacji. Warto zauważyć, że lidokaina wykazuje właściwości przeciwnowotworowe w różnych typach nowotworów, w tym w czerniaku. Może działać jako chemosensytyzator, zwiększając skuteczność leków chemioterapeutycznych, w tym cisplatyny powszechnie stosowanej w elektrochemioterapii. Proponowane mechanizmy jej działania przeciwnowotworowego obejmują hamowanie wzrostu komórek nowotworowych, aktywację szlaków proapoptotycznych, regulację modyfikacji epigenetycznych, zwiększoną produkcję reaktywnych form tlenu (ROS) oraz modulację kluczowych szlaków sygnałowych.

Znaczenie kliniczne wpływu lidokainy na progi elektroporacji pozostaje niepewne. Typowe stężenia lidokainy w tkankach po iniekcji znieczulającej osiągają zaledwie kilka mM, znacznie poniżej stężeń testowanych w badaniu. Jednakże, w tkankach zwłókniałych lub wcześniej napromieniowanych, gdzie dyfuzja leków jest często upośledzona, wstrzykuje się wyższe dawki lidokainy i w konsekwencji oczekuje się wyższych stężeń lokalnych. Ponadto, nawet niewielkie zwiększenie przepuszczalności błony wywołane przez lidokainę może znacznie zwiększyć wchłanianie i cytotoksyczność leków chemioterapeutycznych, takich jak bleomycyna i cisplatyna, stosowanych w elektrochemioterapii.

Poza elektrochemioterapią i nieodwracalną elektroporacją w leczeniu nowotworów, lidokaina ma znaczenie kliniczne w terapii kardiologicznej jako lek antyarytmiczny klasy 1b stosowany w leczeniu arytmii komorowych. FDA niedawno zatwierdziła ablację pulsacyjnym polem elektrycznym (PFA) do leczenia migotania przedsionków, a ta technologia oparta na elektroporacji jest obecnie rozszerzana na zastosowania komorowe. Jednakże stężenia lidokainy w osoczu u pacjentów otrzymujących terapię antyarytmiczną pozostają w zakresie mikromolarnym, znacznie poniżej stężeń testowanych w badaniu, co czyni mało prawdopodobnym, aby klinicznie istotne dawki znacząco wpływały na wyniki elektroporacji w kardiologii.

Badanie podkreśla potencjał lidokainy jako sensytyzatora w terapiach opartych na elektroporacji, szczególnie w przypadku guzów skórnych i przerzutów. Sugeruje również, że należy rozważyć dalsze badania nad synergistycznymi efektami między lidokainą a lekami cytotoksycznymi, zarówno in vitro, jak i in vivo, aby w pełni ocenić potencjał kliniczny tego połączenia. Badania molekularne, takie jak symulacje dynamiki molekularnej badające bezpośrednie interakcje między lidokainą a dwuwarstwą lipidową podczas elektroporacji, mogłyby pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów leżących u podstaw działania lidokainy jako sensytyzatora elektroporacji.

Podsumowanie

Przeprowadzone badania eksperymentalne wykazały, że lidokaina może znacząco wpływać na efektywność elektroporacji, przy czym efekt ten jest zależny od stężenia. Przy niższym stężeniu 10 mM (0,3%) zaobserwowano umiarkowany wpływ na przepuszczalność błony komórkowej i przeżywalność komórek, z najwyraźniejszym efektem w komórkach czerniaka B16-F1. Wyższe stężenie 35 mM (1%) wykazało znacznie silniejsze działanie, prowadząc do prawie dwukrotnego wzrostu objętości tkanki podlegającej nieodwracalnej elektroporacji. Mechanizm działania lidokainy obejmuje modulację ładunku powierzchniowego błony komórkowej, interakcje z fosfolipidami oraz wpływ na kanały sodowe. Mimo obiecujących wyników laboratoryjnych, kliniczne znaczenie tego odkrycia wymaga dalszych badań, szczególnie w kontekście terapii nowotworów i zabiegów kardiologicznych. Potencjał lidokainy jako sensytyzatora w terapiach opartych na elektroporacji wydaje się najbardziej obiecujący w leczeniu guzów skórnych i przerzutów.