Elektrochemiluminescencja w diagnostyce – przełom w wykrywaniu leków

Czy elektrochemiluminescencja zmienia oblicze diagnostyki?

Elektrochemiluminescencja (ECL) to zjawisko luminescencyjne indukowane przez reakcje przenoszenia elektronów na powierzchni elektrody, po raz pierwszy opisane w przełomowych pracach Herculesa i Visco w 1964 roku. ECL zyskała uznanie dzięki wyjątkowym cechom, takim jak minimalna interferencja tła, doskonały stosunek sygnał-szum oraz precyzyjna kontrola czasowa i przestrzenna. Z czasem zastosowanie różnych metodologii ECL rozprzestrzeniło się na wiele dziedzin, obejmujących analizę leków, monitoring środowiskowy i diagnostykę kliniczną. Istotnym kamieniem milowym w ewolucji ECL było wprowadzenie luminoforu Ru(bpy)₃²⁺ przez Barda i Tokela w 1972 roku, zwykle stosowanego w połączeniu z tripropyloaminą (TPA) jako koreaktantem, tworząc klasyczny system ECL. Jednak w tej konfiguracji pojawiają się ograniczenia związane z niewystarczającą szybkością generowania pośrednich produktów reakcji, co utrudnia znaczące wzmocnienie sygnału.

W dążeniu do fascynującej techniki ECL kluczowy jest wybór materiałów elektrodowych o wysokiej aktywności elektrochemicznej. Ostatnie badania podkreśliły skuteczność włączania wysoce aktywnych promotorów w celu udoskonalenia ECL. Zbadano integrację różnych nanomateriałów, wykorzystując ich rozległą powierzchnię, wysoką aktywność reakcji i korzystną biokompatybilność do zwiększenia wydajności urządzeń czujnikowych. Godnym uwagi przesunięciem w tej dziedzinie jest rosnąca preferencja dla nanomateriałów z metali przejściowych, szczególnie w porównaniu z katalizatorami z metali szlachetnych, ze względu na ich łatwą dostępność i obiecujące możliwości elektrochemiczne. Dichalkogenki metali przejściowych (TMDs), charakteryzujące się wiązaniami międzywarstwowymi van der Waalsa, wyłoniły się jako wybitna kategoria nanomateriałów w tym zakresie. Ich wszechstronne zastosowania, od fotoelektrokatalizy po magazynowanie energii i biomedycynę, ilustrują ich potencjał w zwiększaniu ECL. Wybór odpowiednich nanomateriałów jest kluczowy w konstrukcji skutecznych urządzeń ECL. Niedawne postępy uwypukliły rolę elektrod dekorowanych MoS₂ jako potężnych wzmacniaczy sygnału. Na przykład, grupa Zhanga skonstruowała trójwymiarowe, przypominające kwiaty nanomateriały MoS₂ jako promotor sygnału w systemie PTC-PEI/S₂O₈²⁻, co dało czułe wykrywanie metotreksatu. Podobnie, grupa Chu badała ECL Ru(bpy)₃²⁺ na elektrodach modyfikowanych nanoarkuszami MoS₂, podkreślając wzmacnianie anodowego ECL. Ponadto, chociaż NiS nie zyskał takiego uznania jak MoS₂, wykazuje obiecujący potencjał w dziedzinach elektronicznych i optoelektronicznych, sugerując obszar dojrzały do jego rozwoju w technologii ECL.

Chociaż TMDs, takie jak MoS₂, są uznawane za skuteczne akceleratory koreakcji w systemach ECL, w rozwoju urządzeń ECL opartych na TMDs utrzymują się wyzwania. Obejmują one ograniczoną intensywność i wydajność ECL w środowiskach wodnych, a także konieczność stosowania bardziej efektywnych metod integracji właściwości luminoforów z korzystnymi TMDs. Dodatkowo, większość elektrod związanych z TMDs jest głównie skuteczna w katalizowaniu koreakcji, takich jak H₂O₂ lub glukoza, co nieco ogranicza ich szerszy zakres zastosowań. Ponadto, wpływ równoczesnych procesów reakcji ewolucji tlenu (OER) i udziału reaktywnych form tlenu (ROS) w systemach ECL jest często pomijany i wymaga dalszych badań. Ponadto, kompleksowy mechanizm wielofunkcyjnych TMDs w systemach ECL nie został przejrzyście wyprowadzony i wyraźnie wyjaśniony według naszej najlepszej wiedzy.

Aby rozwiązać wcześniej zidentyfikowane wyzwania, trójwymiarowa struktura faveolarna złożona z nanohybrydowego materiału MoS₂ i NiS (NiMoS) została zsyntetyzowana i ozdobiona Ru(bpy)₃²⁺ poprzez przyciąganie elektrostatyczne, tworząc elektrodę Ru@NiMoS z efektem synergicznym. Właściwości katalityczne NiMoS znacząco wzmocniły interakcję między Ru(bpy)₃²⁺ i TPA w reakcji anodowej ECL, głównie poprzez promowanie szybkości OER. W konsekwencji system Ru@NiMoS/TPA osiągnął jakościowy skok we wzmocnieniu sygnału (172,2-krotnie w porównaniu z Ru) i doskonałą wydajność ECL (36,9-krotnie w porównaniu z Ru). Te ulepszenia znacznie podniosły wydajność analityczną immunosensorów. Ponadto, sensor oparty na Ru@NiMoS został skutecznie zastosowany do wykrywania lidokainy, demonstrując granicę wykrywalności na poziomie zaledwie 0,22 nM.

Czy mikrostruktura NiMoS wpływa na wydajność czujników?

W tym badaniu NiMoS jest kluczowy dla wydajności sensora. W celu zbadania morfologicznych i mikrostrukturalnych charakterystyk NiMoS, do szczegółowej obserwacji zastosowano skaningową mikroskopię elektronową (SEM) i transmisyjną mikroskopię elektronową (TEM). Obraz SEM ujawnił, że NiMoS wykazywał trójwymiarową strukturę faveolarną. Połączone arkusze NiMoS tworzyły nieregularne pory, zapewniając znaczną dostępną powierzchnię. Ta dwuwymiarowa morfologia przypominająca arkusze NiMoS jest żywo przedstawiona na Rysunku 1a. Obraz wysokorozdzielczej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (HRTEM) pokazał ułożone warstwowo NiMoS z odstępami międzywarstwowymi wynoszącymi 0,615 i 0,273 nm, odpowiadającymi płaszczyznom (002) i (100) MoS₂. Wzory dyfrakcji elektronów z wybranego obszaru potwierdziły te obserwacje dwoma zestawami koncentrycznych pierścieni. Skany spektroskopii dyspersji energii (EDS) kompozytów NiMoS ujawniły wyraźny podział rozkładu Ni i Mo w strukturze ultracienkich nanoarkuszy, przy czym NiS wykazywał punktowy rozkład w matrycy NiMoS. Te dowody potwierdziły udaną syntezę hybrydowych struktur MoS₂ i NiS.

Obraz SEM na Rysunku 1e przedstawia gładką powierzchnię czystej pianki niklowej (NF). Na Rysunku 1f zaobserwowano drobne, złuszczone płatki Ru(bpy)₃²⁺ przylegające do NF z Nafionem jako spoiwem. W przeciwieństwie do tego, Ru@NiMoS (Rysunek 1g) wykazywał grubą, puszystą powierzchnię, wskazującą na masywne materiały aktywne. Powiększony obraz SEM (Rysunek 1h) uwydatnił regularny kształt Ru(bpy)₃²⁺, podkreślając wydajną absorpcję poprzez przyciąganie elektrostatyczne. Pomiary potencjału zeta potwierdziły to przyciąganie elektrostatyczne, przy czym NiMoS wykazywał potencjał -24,12 mV, sugerując immobilizację dodatnio naładowanego Ru(bpy)₃²⁺ na ujemnie naładowanym NiMoS. Atomy siarki na powierzchni nanoarkuszy NiMoS oferują wolne orbitale dla wydajnej immobilizacji kationowego Ru(bpy)₃²⁺. EDS kompozytów Ru@NiMoS wykazał rozkłady pierwiastków Ru, Cl, O, N, S, Ni i Mo, wskazując na efektywne sieciowanie NiMoS i Ru(bpy)₃²⁺. Kompleksowa charakterystyka strukturalna zsyntetyzowanych kompozytów została określona poprzez analizy dyfrakcji rentgenowskiej (XRD) i spektroskopii fotoelektronów rentgenowskich (XPS). Dyfrakcja rentgenowska ujawniła wyraźne piki dyfrakcyjne MoS₂ (JCPDS 37-1492), NiS (JCPDS 12-0041) i Ru(bpy)₃²⁺ zgodne z istniejącą literaturą i potwierdziła minimalny wpływ włączenia Ru(bpy)₃²⁺ na sieć krystaliczną NiMoS. Analiza XPS dodatkowo wyjaśniła stan chemiczny pierwiastków poprzez widma rdzeniowe Mo 3d, Ni 2p i S 2p. Wyniki analityczne zbiorowo potwierdziły, że integralność chemiczna Ru(bpy)₃²⁺ jest zachowana w próbce Ru@NiMoS. Co godne uwagi, Ru@NiMoS wykazywał zwiększony stosunek Mo:S w porównaniu do NiMoS, wskazując na tworzenie wiązań Mo-O i Ru-S. Porównawcza ocena stosunków Ni:S podkreśliła zmniejszenie atomów siarki na powierzchni Ru@NiMoS, sugerując kluczową rolę siarki w stabilizacji rutenu w matrycy. Ustalenia z EDS, XRD i XPS spójnie wskazywały na udane zakotwiczenie Ru(bpy)₃²⁺ na strukturze NiMoS. Spektroskopia UV-vis (Rysunek 1i) porównała absorpcję błękitu metylenowego w oryginalnych roztworach i roztworach nasączonych NF i NiMoS. Charakterystyczne piki przy 520 i 580 nm ujawniły niższą absorbancję w roztworze nasączonym NiMoS w porównaniu do NF, wskazując na więcej cząsteczek barwnika zaadsorbowanych na powierzchni NiMoS. To potwierdziło zwiększoną dostępną powierzchnię NiMoS, niezbędną dla licznych aktywnych miejsc katalitycznych.

Jak zoptymalizować elektrochemiczne reakcje w systemach ECL?

W celu optymalizacji wzbogacenia ECL Ru@NiMoS, metodycznie dostosowano kilka parametrów, w tym szybkość skanowania, stężenie buforu fosforanowego (PBS), stężenie TPA i poziom pH elektrolitu. Najbardziej sprzyjające warunki zidentyfikowano jako 0,075 M PBS z 0,02 M TPA jako elektrolitem przy pH 11 i szybkości skanowania 120 mV s⁻¹. Porównawcze eksperymenty ECL Ru i Ru@NiMoS przeprowadzono w tych zoptymalizowanych warunkach na Rysunku 2a. Ru wykazywał słaby sygnał na poziomie 97 au, przypisywany nieodłącznej auto-luminescencji Ru(bpy)₃²⁺. Natomiast nadzwyczajna luminescencja Ru@NiMoS osiągnęła maksymalną intensywność 16 708 au, dramatycznie przewyższając około 172,2-krotnie w porównaniu do Ru. Aby wyjaśnić, jak podłoże NiMoS wpływa na ECL, zbadano właściwości luminescencyjne samego NiMoS. NiMoS nie generował żadnej odpowiedzi luminescencyjnej w pozycji swojego piku prądowego, potwierdzając tym samym swoje wewnętrzne nieświecące właściwości.

Dalsza analiza poprzez woltamperometrię cykliczną, jak przedstawiono na Rysunku 2b, zidentyfikowała wyraźne ramiona prądowe przy 1,3 V dla obu próbek, które były zgodne z zachowaniami OER w ograniczonym oknie potencjałowym roztworów wodnych, teoretycznie przy 1,229 V. Co godne uwagi, Ru@NiMoS wykazywał znacznie zwiększoną naturę elektroaktywną w porównaniu do Ru, wskazując na wyższą zdolność oksydoredukcyjną, która jest przypisywana komponentowi MoS₂ służącemu jako rezerwuar do redystrybucji elektronów. Ponadto, anodowy pik prądowy Ru@NiMoS był 13,2 razy wyższy niż Ru przy 0,8 V, zgodny z generowaniem wolnych kationorodników TPA. Ponadto, wydajność ECL Ru i Ru@NiMoS została obliczona na podstawie względnego stosunku zintegrowanej emisji fotonów do szybkości transportu elektronów. Ru@NiMoS osiągnął godną uwagi wydajność ECL wynoszącą 70,1%, która jest 36,9 razy wyższa niż Ru. Powtarzalność również zajmuje krytyczne znaczenie. Ru@NiMoS wykazywał spójną wydajność w 10 oddzielnych skanach, z względnym odchyleniem standardowym wynoszącym tylko 0,53%, podkreślając jego niezawodność.

Czy Ru@NiMoS stanowi przełom w wykrywaniu leków?

Spektroskopia impedancji elektrochemicznej została zastosowana do oceny korelacji między właściwościami elektrochemicznymi a efektami ECL Ru i Ru@NiMoS, jak przedstawiono na Rysunku 3a. Równoważny obwód (pokazany na wkładce) określił faradajowski opór przenoszenia ładunku na granicy faz (Rct) przy wysokiej częstotliwości, a wartości Rct wynosiły 374 Ω dla Ru i 748 Ω dla Ru@NiMoS. Ta zwiększona przewodność dla Ru@NiMoS została przypisana aglomeracji znacznej ilości NiMoS i Ru(bpy)₃²⁺. Dlatego zmieniona przewodność elektrody kompleksu rutenu nie była powodem promowania sygnału ECL, ale stawiała ograniczenia dla kinetyki elektrody i wydajności reakcji elektrochemicznych.

Aktywności OER badano przy użyciu krzywych woltamperometrii liniowej (LSV) przy szybkości skanowania 5 mV s⁻¹ w środowisku alkalicznym, jak określono na Rysunku 3b. Zarówno Ru, jak i NiMoS wykazywały potencjał początkowy 1,4 V, a natężenie prądu NiMoS znacznie wzrosło w porównaniu do Ru, osiągając końcową gęstość prądu NiMoS trzykrotnie większą niż Ru. Krytycznym aspektem procesu OER było generowanie tlenu singletowego (O₂), który mógł być adsorbowany przez aktywne miejsca na NiMoS. Następnie O₂ był katalizowany w celu wytworzenia ROS, takich jak rodniki nadtlenkowe (O₂*⁻), rodniki hydroksylowe (OH*) i rodniki wodoronadtlenkowe (HO₂*⁻). Zgodnie z literaturą, te ROS są instrumentalne w zwiększaniu odpowiedzi ECL. Ponadto, porowata struktura NiMoS oferowała kanały dla szybkiej dyfuzji tlenu do aktywnych miejsc, przedłużając jego interakcję z katalizatorem NiMoS, tym samym sprzyjając generowaniu ROS. Rysunek 3c ilustrował zachowanie ECL Ru@NiMoS w obecności zmiatacza rodników, definitywnie potwierdzając udział ROS w systemie Ru(bpy)₃²⁺/TPA. Wpływ O₂*⁻ badano przy użyciu dysmutazy ponadtlenkowej, która eliminowała O₂*⁻. Ta interwencja doprowadziła do ostrego spadku sygnału ECL, jak wyraźnie zilustrowano na Rysunku 3c (czerwona linia). Dalsze badania dotyczące tworzenia i wpływu innych pośredników pochodnych tlenu w procesie ECL prowadzono, badając odpowiedź ECL po usunięciu HO₂*⁻, OH* i O₂*⁻ w obecności kwasu askorbinowego. Jak pokazano na Rysunku 3c (niebieska linia), zaobserwowano ciągłe zmniejszanie intensywności ECL, wzmacniając kluczową rolę ścieżki ROS w reakcji ECL. Rysunek 3d przedstawiał wpływ różnych stężeń TPA (0-40 mM) na odpowiedzi prądowe NF i NiMoS, mający na celu ocenę wydajności katalitycznej NiMoS jako promotora koreakcji. Gęstość prądu NF wykazywała marginalny wzrost ze wzrostem stężeń TPA, podczas gdy gęstość prądu NiMoS wykazywała znaczne wzmocnienie, podkreślając wyższą aktywność elektrokatalityczną NiMoS w ułatwianiu rozkładu TPA. Przede wszystkim, te ustalenia nie tylko potwierdziły kluczową rolę ROS, ale również potwierdziły ułatwienie katalityczne zapewniane przez NiMoS w procesie koreakcji ECL.

Ponieważ grupy funkcyjne aminowe odgrywają kluczową rolę jako koreaktant w reakcji ECL z luminoforem Ru(bpy)₃²⁺, kompleksowy mechanistyczny wkład wielofunkcyjnego NiMoS w systemie koreaktantowym opartym na kompleksach rutenu został przedstawiony na Rysunku 4. Początkowo NiMoS wykazywał godną uwagi wydajność OER, prowadząc do generowania znacznych ilości O₂ (Równanie 1). O₂ był następnie adsorbowany i katalitycznie przetwarzany w miejscach wakancji tlenowych nanoarkuszy NiMoS, co skutkowało produkcją ROS (Równanie 2). Te ROS, charakteryzujące się potężnymi zdolnościami utleniającymi, wydajnie utleniały Ru(bpy)₃²⁺ i substancje zawierające aminy (ACS). Współpraca ROS i aktywnych miejsc NiMoS znacznie przyspieszyła transmutację koreaktanta i luminoforu w wygórowane jony rodnikowe (Równania 3 i 4). Wygenerowany kation ACS*⁺ ulegał deprotonacji z węgla α, tworząc ACS*, proces, który był modulowany przez zdolność absorpcji protonów alkalicznego elektrolitu wspierającego (Równanie 5). Ten krok był kluczowy, ponieważ jest ograniczający szybkość, biorąc pod uwagę krótki okres półtrwania pośredników (t₁/₂–200 μs). Ponadto, znaczny transfer elektronów z ACS* do orbitalu π* liganda Ru(bpy)₃³⁺ ułatwiał wzbudzenie Ru(bpy)₃²⁺* (Równanie 6). W końcu wzbudzone gatunki Ru(bpy)₃²⁺* zanikały do stanu podstawowego po skanowaniu do 1,3 V, uwalniając energię jako wyraźny sygnał optyczny (Równanie 7). Ogólnie, NiMoS funkcjonował jako gatunek pomostowy dla reakcji ECL i OER z wygenerowanymi ROS. Nano-NiMoS nie tylko wydajnie wzbogacał Ru(bpy)₃²⁺, ale także wykazywał aktywność katalityczną w stosunku do koreaktanta, zwiększając tym samym zlokalizowane stężenie aktywnych jonów w stanie wzbudzonym na powierzchni elektrody, co z kolei prowadzi do zwiększonej wydajności ECL.

Ru@NiMoS wykazał godny uwagi potencjał jako wysoce czuła platforma sensorowa. Lidokaina, lek znieczulający i antyarytmiczny historycznie nękany wyzwaniami związanymi z czułością i selektywnością, została zastosowana jako koreaktant dla Ru(bpy)₃²⁺. W tym badaniu opracowano sensor typu “signal-on” wykorzystujący elektrodę Ru@NiMoS w celu ułatwienia ulepszonej analizy ECL lidokainy, włączając azotyn (NO₂⁻) jako specyficzny czynnik przesiewowy. To włączenie NO₂⁻ skutecznie różnicowało lidokainę od innych ACS, tym samym podnosząc specyficzność testu. Jak przedstawiono na Rysunku 5a, bezpośredni proporcjonalny związek został rozpoznany między intensywnością ECL a stężeniem lidokainy, obejmując szeroki liniowy zakres od 1 nM do 1 μM. Co godne uwagi, spójne wartości intensywności luminescencji zostały powielone w trzech niezależnych eksperymentach. Rysunek 5b dodatkowo opisywał pożądaną liniową korelację między intensywnością ECL a logarytmem stężenia lidokainy ze standardowym równaniem dopasowania I_ECL = 3962lg_(C)+3713 (R² = 0,989). Granica wykrywalności została określona na imponująco niskim poziomie 0,22 nM. Rysunek 5c przedstawiał odpowiedzi ECL w obecności 29 różnych potencjalnych interferencji, aby ocenić selektywność. Co godne uwagi, intensywność ECL dla tych substancji nie przekraczała progu wykrywalności specyficznego dla lidokainy. Zbadano wykonalność sensorów opartych na Ru@NiMoS do analizy lidokainy w próbkach ludzkiej surowicy, a sensor wykazał rozsądne wskaźniki odzysku w różnych stężeniach (10 μM, 1 μM i 100 nM), wahające się odpowiednio od 92,6% do 103,4%, 91%–109% i 97,23%–106,73%. Te ustalenia potwierdziły wyższą czułość i selektywność zaprojektowanego sensora, tym samym wzmacniając jego potencjał jako wysoce skutecznego narzędzia do precyzyjnego wykrywania lidokainy.

Podsumowując, to badanie przedstawiło kompleksowe dochodzenie dotyczące integracji NiMoS w systemie ECL Ru(bpy)₃²⁺/TPA, gdzie NiMoS działał zarówno jako elektrokatalizator, jak i struktura ramowa. Dzięki jego wybitnym aktywnościom OER i katalitycznym utleniania, generowanie aktywnych wolnych rodników zostało znacznie zwiększone, tym samym zwiększając skuteczność ECL. Efekt synergiczny między NiMoS a Ru(bpy)₃²⁺ doprowadził do wyjątkowej wydajności ECL, przy czym intensywność ECL Ru@NiMoS była 172,2 razy większa niż Ru, a wydajność ECL Ru@NiMoS wynosiła 70,1% — poprawę o 36,9 w stosunku do Ru. Dodatkowo, strategia wzmocnienia sygnału została zastosowana do badania lidokainy, osiągając godny uwagi niski limit wykrywalności 0,22 nM. Ta strategia zapewnia obiecującą ścieżkę dla wykonalnego przygotowania i mechanizmu referencyjnego przyszłych systemów ECL z udziałem TMDs.

Jak przygotować Ru@NiMoS krok po kroku?

Synteza Ru@NiMoS obejmowała łatwy dwustopniowy proces, obejmujący obróbkę hydrotermalną i późniejszą inkubację, jak pokazano na Schemacie 1. Początkowo kawałek NF o wymiarach 3 × 2 cm² poddano czyszczeniu ultradźwiękowemu w acetonie, etanolu i dejonizowanej wodzie przez 20 min każdy. Następnie przygotowano 20 ml jednorodnego roztworu poprzez energiczne mieszanie mieszaniny 4 mM Na₂MoO₄ i 8 mM tiomocznika. Wstępnie oczyszczony NF został następnie zanurzony w tym roztworze prekursora. Ten zespół został przeniesiony do autoklawu wyłożonego teflonem i utrzymywany w temperaturze 180°C przez 24 h. Otrzymany produkt został dokładnie przepłukany trzykrotnie dejonizowaną wodą i alkoholem, a następnie wysuszony w piecu próżniowym w temperaturze 80°C przez 4 h w celu uzyskania NiMoS. W ostatnim kroku NiMoS zanurzono w 10 mM roztworze Ru(bpy)₃²⁺, ułatwiając mocowanie Ru(bpy)₃²⁺ na powierzchni elektrody poprzez przyciąganie elektrostatyczne, co doprowadziło do powstania Ru@NiMoS. Do celów porównawczych przygotowano Ru przez zanurzenie oczyszczonego NF w 10 mM zawiesinie Ru(bpy)₃²⁺ z Nafionem jako spoiwem, a następnie suszenie w temperaturze pokojowej.

Podsumowanie

Badanie przedstawia znaczący postęp w dziedzinie elektrochemiluminescencji poprzez opracowanie innowacyjnego materiału Ru@NiMoS. System ten wykazuje wyjątkową wydajność w diagnostyce, osiągając 172,2-krotne wzmocnienie sygnału w porównaniu do standardowego układu Ru oraz 36,9-krotny wzrost wydajności ECL. Kluczowym osiągnięciem jest wykorzystanie tego systemu do wykrywania lidokainy z niezwykle niską granicą wykrywalności 0,22 nM. Materiał charakteryzuje się trójwymiarową strukturą faveolarną i wykazuje doskonałą selektywność w obecności różnych interferentów. Mechanizm działania opiera się na synergicznym efekcie między NiMoS a Ru(bpy)₃²⁺, gdzie NiMoS pełni rolę zarówno elektrokatalizatora, jak i struktury nośnej. Technologia ta otwiera nowe możliwości w diagnostyce klinicznej, oferując wysoką precyzję i czułość w wykrywaniu substancji leczniczych.